28°C पर 25 दिनों तक स्थिर इनक्यूबेशन के बाद, *Pleurotus ostreatus* NRC620 से प्राप्त लैकेस एंजाइम ने कवक संवर्धन माध्यम में उच्चतम सक्रियता प्रदर्शित की। इस एंजाइम के लिए इष्टतम pH और तापमान मान क्रमशः 3.0 और 70°C थे। 40°C और 50°C पर 2 घंटे के इनक्यूबेशन के बाद, एंजाइम की सक्रियता क्रमशः 68.33% और 59.61% बनी रही। साइट्रेट-फॉस्फेट बफर (pH 7.0) में 2 घंटे के इनक्यूबेशन के बाद, एंजाइम की सक्रियता 100% पर बनी रही। 10 mM MgSO₄ और CuSO₄ के मिलाने से एंजाइम की सक्रियता में क्रमशः लगभग 21% और 35% की वृद्धि हुई, जबकि NaCl, MnCl₂, KCl और CaCl₂ ने एंजाइम की सक्रियता को बाधित किया। ABTS को सबस्ट्रेट के रूप में उपयोग करते हुए, *Pleurotus ostreatus* NRC 620 लैकेस के गतिज मापदंड (Km और Vmax) क्रमशः 1.99 mM और 16,217 μmol min−1 L−1 थे। सेब के रस के नमूनों के एंजाइमी उपचार से pH और चिपचिपाहट दोनों में उल्लेखनीय कमी आई, और यह कमी भंडारण समय में वृद्धि के साथ सहसंबंधित थी। लैकेस उपचार के परिणामस्वरूप सेब के रस की कुल फेनोलिक सामग्री में थोड़ी कमी आई, लेकिन एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि में कोई कमी नहीं देखी गई।
हाल के वर्षों में, शोधकर्ताओं ने खाद्य उद्योग में हरित जैव प्रौद्योगिकी के अनुप्रयोग पर ध्यान केंद्रित किया है। लैकेस खाद्य उद्योग में सबसे उपयोगी एंजाइमों में से एक है, जिसका उपयोग जूस प्रसंस्करण, बेकिंग, वाइन स्थिरीकरण और खाद्य उत्पादों के स्वाद और सुगंध में सुधार जैसे क्षेत्रों में होता है।1कई उच्च पौधे और सूक्ष्मजीव लैकेस एंजाइम स्रावित करते हैं।2और ड्यूटेरोमाइसेट्स, एस्कोमाइसेट्स और बेसिडियोमाइसेट्स जैसे कवक भी लैकेस का उत्पादन कर सकते हैं।3लैकेस (EC 1.10.3.2) एक नीला ऑक्सीडेज एंजाइम है जो तीन अलग-अलग तांबे के परमाणुओं से बनी प्रणाली का उपयोग करके आणविक ऑक्सीजन को पानी में बदल देता है, जिससे विभिन्न फेनोलिक यौगिकों और सुगंधित अमीन्स का ऑक्सीकरण होता है। फलों और सब्जियों के रस के उत्पादन के दौरान, एंजाइमेटिक और गैर-एंजाइमेटिक भूरापन एक महत्वपूर्ण समस्या है।4चूंकि ये पदार्थ जूस के रंग, स्वाद और सुगंध पर नकारात्मक प्रभाव डालते हैं, इसलिए इन्हें हटाना आवश्यक है।5
सभी फलों में, सेब विश्व स्तर पर और यूरोपीय संघ में सबसे अधिक खाया जाने वाला फल है। 2019 में, सेब का उत्पादन वैश्विक स्तर पर तीसरे स्थान पर था, जो 87 मिलियन टन से अधिक था।6सेब में कई फेनोलिक यौगिक पाए जाते हैं, जिनमें फ्लेवोनोइड्स और फेनोलिक एसिड जैसे कैफिक एसिड और क्लोरोजेनिक एसिड शामिल हैं।7क्योंकि सेब का रस आमतौर पर अपने साफ रूप में ही पिया जाता है, इसलिए छानने की प्रक्रिया के दौरान लगभग 50% से 90% तक फेनोलिक घटक नष्ट हो जाते हैं।8आजकल उपभोक्ता कम से कम संसाधित उत्पादों को प्राथमिकता देते हैं, जैसे कि उच्च पॉलीफेनॉल सामग्री वाला धुंधला सेब का रस। हालांकि, इसमें मौजूद उच्च फेनोलिक तत्व के कारण, इस प्रकार के सेब के रस में रंग बदलने और काला पड़ने की संभावना अधिक होती है।9सेब के रस के रंग को गहरा होने से बचाने या कम करने के लिए 60-90 डिग्री सेल्सियस पर पाश्चुरीकरण जैसी ताप उपचार विधियों सहित विभिन्न तकनीकों का उपयोग किया जाता है।10हालाँकि, सॉसेडा-गैल्वेज़ के शोध के अनुसार11ऊष्मीय प्रक्रिया से वाष्पशील रसायन नष्ट हो सकते हैं और सेब के रस के स्वाद और सुगंध पर असर पड़ सकता है। ऊष्मीय प्रक्रिया के विकल्पों में सुपरक्रिटिकल कार्बन डाइऑक्साइड, पराबैंगनी विकिरण, अल्ट्रासाउंड, उच्च जलस्थैतिक दाब या उच्च दाब समरूपीकरण शामिल हैं।12इन तकनीकों की दक्षता और उपयुक्त फलों के रस की पैदावार उपयोग किए गए मापदंडों और उत्पाद की विशेषताओं पर निर्भर करती है। इनका व्यापक उपयोग उच्च लागत, कुछ खाद्य उत्पादों की गुणवत्ता पर प्रतिकूल प्रभाव या अपर्याप्त एंजाइम निष्क्रियता के कारण सीमित है।13,14
लैकेस का उपयोग फलों के रस को स्थिर और स्पष्ट करने के लिए किया जा सकता है।15गोकमैन एट अल.16फलों के रस को शुद्ध करने के लिए लैकेस एंजाइम के उपयोग की अनुशंसा की जाती है क्योंकि यह फेनोलिक यौगिकों को पॉलिमर या ओलिगोमर में परिवर्तित करके उन्हें प्रभावी ढंग से हटा देता है, जिन्हें किसी भी अल्ट्राफिल्ट्रेशन झिल्ली द्वारा आसानी से हटाया जा सकता है। इससे सेब का रस 50°C तापमान पर छह सप्ताह तक स्थिर रंग और स्पष्टता बनाए रख सकता है। शुद्ध ट्राइकोडर्मा लैकेस एंजाइम को एल्यूमिना बीड्स पर स्थिर किया गया और इसका उपयोग सेब के रस में सूक्ष्मजीवों द्वारा संदूषण के कारण उत्पन्न होने वाले अप्रिय स्वाद वाले यौगिकों को चुनिंदा रूप से हटाने के लिए किया गया।17
सेब के रस के वाष्पशील घटकों में से लगभग 80-90% एस्टर और एल्डिहाइड होते हैं, जो रस को एक अनूठी सुगंध प्रदान करते हैं।18सेब के रस को शुद्ध करने के लिए, *ट्रैमेट्स वर्सिकोलर* से प्राप्त लैकेस एंजाइम को कच्चे नारियल के छिलकों से प्राप्त प्राकृतिक रेशों से बने एक सस्ते आधार पर स्थिर किया गया था।19पिछले अध्ययनों में एंजाइम-मुक्त या स्थिरीकरण विधियों का उपयोग करके, या अल्ट्राफिल्ट्रेशन के संयोजन में सेब के रस के स्थिरीकरण (रंग और धुंधलापन) की जांच की गई है।5,19हालांकि, भंडारण के दौरान सेब के रस के भौतिक-रासायनिक गुणों पर फंगल लैकेस एंजाइमों का प्रभाव अभी भी स्पष्ट नहीं है। इसलिए, इस अध्ययन का उद्देश्य फंगल लैकेस एंजाइमों से उपचार और दो सप्ताह के रेफ्रिजरेटेड भंडारण के बाद सेब के रस के भौतिक-रासायनिक गुणों, फेनोलिक यौगिकों की मात्रा और एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि में होने वाले परिवर्तनों का प्रायोगिक रूप से अध्ययन करना था। लैकेस एंजाइमों में फेनोलिक यौगिकों को ऑक्सीकृत करने की क्षमता होती है, जो उन्हें रस शुद्धिकरण सहित विभिन्न औद्योगिक प्रक्रियाओं में उपयोग के लिए आशाजनक बनाती है। इस अध्ययन में *Pleurotus ostreatus* NRC 620 से प्राप्त लैकेस एंजाइमों का परीक्षण किया गया, जिसमें रस शुद्धिकरण में उनकी गतिविधि और प्रभावशीलता के लिए आदर्श स्थितियों पर ध्यान केंद्रित किया गया। जबकि ऑयस्टर मशरूम (P. ostreatus NRC 620) पर शोध अभी भी सीमित है, पिछले अध्ययनों में विभिन्न फंगल स्रोतों, जैसे कि Trametes versicolor और Ganoderma lucidum से प्राप्त एंजाइमों का परीक्षण किया गया है। इस अध्ययन का उद्देश्य खाद्य उद्योग में इस एंजाइम के संभावित अनुप्रयोग का मूल्यांकन करना और इसके अद्वितीय गुणों, विशेष रूप से इसके आदर्श pH और तापमान को उजागर करना था।
2,2′-एज़ोऑक्सीबिस(3-एथिलबेंज़ोथियाज़ोलिन-6-सल्फोनिक एसिड) (ABTS) सिग्मा-एल्ड्रिच (कनाडा) से खरीदा गया था। अन्य सभी अभिकर्मक विश्लेषणात्मक ग्रेड के थे।
राष्ट्रीय अनुसंधान केंद्र के माइक्रोबियल कल्चर कलेक्शन सेंटर ने ऑयस्टर मशरूम की ज्ञात स्ट्रेन NRC620 प्राप्त की। सबकल्चर के बाद, इस स्ट्रेन को 4°C पर पोटैटो डेक्सट्रोज अगर स्लैंट पर संग्रहित किया गया। इनोक्यूलम तैयार करने की विधि इस प्रकार थी: 10 दिन पुराने, पूरी तरह से विकसित माइसेलियम को पोटैटो डेक्सट्रोज अगर प्लेटों पर इनोक्यूलेट किया गया और 28°C पर इनक्यूबेट किया गया। 10 दिनों के बाद, एक स्टेराइल मेटल पंच का उपयोग करके अगर मीडिया से 12 मिमी व्यास के तीन माइसेलियल ब्लॉक निकाले गए और उन्हें 250 मिलीलीटर एर्लेनमेयर फ्लास्क में कॉटन प्लग के साथ रखा गया, जिसमें 50 मिलीलीटर स्टेराइल कल्चर मीडियम (pH 5.0, जैसा कि पहले ओथमान एट अल द्वारा वर्णित किया गया है) था।20इन कल्चर को 28°C पर 18 दिनों तक इनक्यूबेट किया गया। इसके बाद कल्चर को व्हाटमैन नंबर 1 फिल्टर पेपर से छाना गया और परिणामी सुपरनेटेंट को एंजाइम स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया गया।
लैकेस एंजाइम की सक्रियता का निर्धारण एबीटीएस को सब्सट्रेट के रूप में उपयोग करके किया गया था। अभिक्रिया मिश्रण (2 मिलीलीटर) में 0.3 मिलीएम एबीटीएस (0.1 मिली सोडियम साइट्रेट बफर, पीएच 4.5 में घुला हुआ) का 500 माइक्रोलीटर और आसुत जल से पतला किया गया एंजाइम नमूना की आवश्यक मात्रा शामिल थी।21,22यह देखते हुए कि लैकेस एंजाइम कमरे के तापमान (28 डिग्री सेल्सियस ± 2) पर एबीटीएस को ऑक्सीकृत कर सकता है, एबीटीएस ऑक्सीकरण का निर्धारण 420 एनएम (ε) पर अवशोषण में वृद्धि को मापकर किया गया।420= 36,000 सेमी-1 M -1एजिलेंट कैरी-100 यूवी स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके लैकेस गतिविधि की एक इकाई का निर्धारण किया गया। प्रति मिनट 1 μmol ABTS को ऑक्सीकृत करने के लिए लैकेस गतिविधि की एक इकाई आवश्यक थी। प्रोटीन सांद्रता का निर्धारण ब्रैडफोर्ड विधि द्वारा किया गया, जिसमें आंतरिक नियंत्रण के रूप में बोवाइन सीरम एल्ब्यूमिन का उपयोग किया गया।23,24
ऑयस्टर मशरूम स्ट्रेन एनआरसी 620 से एंजाइम प्राप्त करने के बाद, 28 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर परिस्थितियों में 25 दिनों तक विभिन्न संवर्धन अंतरालों पर इसकी गतिविधि को मापा गया।
लैकेस एंजाइम की गतिविधि पर तापमान के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, 20 से 90 डिग्री सेल्सियस के तापमान रेंज में प्रयोग किए गए। एंजाइम मिलाने और अभिक्रिया शुरू करने से पहले, बफर (0.1 M सोडियम साइट्रेट, pH 4.5) और सबस्ट्रेट (ABTS) को मिलाया गया और विभिन्न तापमानों पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया। एंजाइम की ऊष्मीय स्थिरता का आकलन 0.05 M सोडियम फॉस्फेट बफर (pH 7.0) में क्रमशः 40, 50, 60 और 70 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करके किया गया। इसके बाद, ABTS सबस्ट्रेट का उपयोग करके अवशिष्ट गतिविधि का आकलन किया गया।
लैकेस एंजाइम की गतिविधि पर pH के प्रभाव का आकलन 0.1 M साइट्रेट-फॉस्फेट बफर में ABTS को सबस्ट्रेट के रूप में उपयोग करके किया गया, जिसका pH मान 2.5 से 7.0 के बीच था। pH स्थिरता का आकलन करने के लिए एंजाइम विलयन को 0.1 M साइट्रेट और ट्रिस बफर (pH 3, 4, 6 और 7) में 40°C पर दो घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। इनक्यूबेशन के बाद ABTS को सबस्ट्रेट के रूप में उपयोग करके अवशिष्ट गतिविधि की गणना की गई।
लैकेस एंजाइम को विभिन्न धातु आयनों (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+, और Mn2+) की 2.5 mM और 10 mM सांद्रता वाले सोडियम फॉस्फेट बफर (0.05 M, pH 7.0) में 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया। इसके बाद अभिक्रिया शुरू करने के लिए सब्सट्रेट (ABTS) मिलाया गया और सापेक्ष सक्रियता का आकलन किया गया।
विभिन्न सांद्रताओं (0.025–3 mM) पर लैकेस द्वारा ABTS ऑक्सीकरण को pH 4.5 पर मापा गया ताकि गतिज मापदंडों (Vmax और Km) का निर्धारण किया जा सके।स्थिरांकमाइकलिस-मेंटेन समीकरण के मानों की गणना लिनवेवर-बर्क प्लॉट का उपयोग करके की गई, जो अभिक्रिया दर के व्युत्क्रम को सब्सट्रेट सांद्रता के फलन के रूप में दर्शाता है। लिनवेवर-बर्क प्लॉट से गतिज स्थिरांकों की गणना ग्राफपैड प्रिज्म संस्करण 6.01 सॉफ्टवेयर का उपयोग करके की गई।
सेबों को नल के पानी से अच्छी तरह धोने के बाद, उन्हें बीच से काटकर जर्मनी में निर्मित पूरी तरह से स्वचालित ब्रौन एमपी80 सेब जूसर का उपयोग करके उनका रस निकाला गया। रस को चार परतों वाले मलमल के कपड़े से छाना गया। नियंत्रण समूह में कोई एंजाइम नहीं मिलाया गया, जबकि ताजे तैयार किए गए सेब के रस में 2.0% लैकेस (परीक्षण की गई सबसे प्रभावी सांद्रता) मिलाया गया, जिसे बाद में दो सप्ताह के लिए 4°C पर संग्रहित किया गया।
बोल्टन एट अल की विधि के अनुसार टाइट्रेबल अम्लता (टीए) और पीएच का निर्धारण किया गया।अल.27प्रत्येक नमूने का पीएच डिजिटल पीएच मीटर (जेनवे 3510 पीएच मीटर) का उपयोग करके मापा गया। मैलिक एसिड के आधार पर निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके टाइट्रेबल अम्लता (टीए) की गणना की गई।
यहां V और C अनुमापन में प्रयुक्त सोडियम हाइड्रॉक्साइड विलयन का आयतन (मिलीलीटर) और सांद्रता (0.1 मोल/लीटर) हैं। K मैलिक अम्ल रूपांतरण गुणांक है, जिसका मान 0.067 है, और W सेब के रस का द्रव्यमान (ग्राम) है।
कुल घुलनशील ठोस पदार्थ (टीडीएससभी सेब के रस के नमूनों में मौजूद मात्रा का निर्धारण PAL-1 पॉकेट रिफ्रैक्टोमीटर (ATAGO, टोक्यो, जापान) का उपयोग करके किया गया। प्रत्येक माप के बाद, ऑप्टिकल लेंस को विआयनीकृत जल से धोया गया और सेब के रस के प्रत्येक नमूने का तीन बार परीक्षण किया गया। प्रत्येक नमूने का मान तीनों मापों का औसत निकालकर निकाला गया। प्रत्येक सेब के रस के नमूने का माध्य ± मानक विचलन भी इन परिणामों का औसत निकालकर निकाला गया।
सेब के रस के नमूनों की श्यानता का आकलन घूर्णी विस्कोमीटर (RV, Rheotest 2, जर्मनी) का उपयोग करके किया गया। नमूने को विस्कोमीटर के "S2" सिलेंडर के अंदर रखा गया। आभासी श्यानता को अपरूपण तनाव बनाम अपरूपण दर वक्र की ढलान द्वारा दर्शाया गया, जिसकी गणना अपरूपण तनाव और विभिन्न अपरूपण दरों (1.00 से 437.4 s⁻¹) पर संबंधित वक्रों से की गई। आभासी श्यानता की गणना का सूत्र इस प्रकार है:
जहां η आभासी श्यानता (cP) है, τ अपरूपण तनाव (dyn/cm²) है, γ अपरूपण दर (sec⁻¹) है, और (τ) की गणना टॉर्क (α) और सिलेंडर (Z) मानों का उपयोग करके निम्न सूत्र से की जाती है: τ = Z . α.
भूरापन सूचकांक का निर्धारण मेइदाव एट की विधि के अनुसार किया गया था।अल.2910 मिलीलीटर जूस के नमूने को 2750 xg पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज किया गया। जूस के सुपरनेटेंट के 5 मिलीलीटर को 95% इथेनॉल के 5 मिलीलीटर के साथ मिलाया गया। मिश्रण के अवशोषण को शिमाद्ज़ू यूवी स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (UV-1601 PC) का उपयोग करके 420 nm पर मापा गया।
कुल फेनोलिक सामग्री (टीपीसी) का निर्धारण बोल्टन एट अल द्वारा वर्णित विधि के अनुसार फोलिन-सियोकाल्टेउ अभिकर्मक का उपयोग करके रंगमापी विधि से किया गया था।[27गैलिक एसिड की 0 से 500 मिलीग्राम/लीटर सांद्रता के लिए एक मानक वक्र तैयार किया गया था।आर²= 0.997)। परिणामों को गैलिक एसिड समतुल्य (मिलीग्राम जीएई/एमएल) के रूप में व्यक्त किया जाता है।
25 μL सेब के रस में 125 μL आसुत जल और 2850 μL FRAP घोल मिलाएं और मिश्रण को अंधेरे में रख दें।30मिनट। फिर शिमाद्ज़ू यूवी स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (यूवी-1601 पीसी) का उपयोग करके 593 एनएम पर अवशोषण को मापें। एफआरएपी अभिकर्मक को 300 एमएल एसीटेट बफर (पीएच 3.6), 20 एमएल आयरन(III) क्लोराइड और 10 एमएल 2,4,6-ट्रिस(2-पाइरिडिल)ट्रायज़ीन (टीपीटीजेड) (40 एमएल एचसीएल में घुला हुआ) को 10:1:1 के अनुपात में मिलाकर तैयार किया गया था। ट्रोलोक्स को मानक के रूप में उपयोग करके एक मानक वक्र उत्पन्न किया गया था।आर²= 0.999), और परिणामों को μM ट्रोलोक्स/mL के रूप में व्यक्त किया जाता है।
उपचारित और अनुपचारित रसों की एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि का निर्धारण डीपीपीएच विधि का उपयोग करके किया गया ताकि डीपीपीएच मुक्त कणों को नष्ट करने की उनकी क्षमता का मूल्यांकन किया जा सके।31दस माइक्रोलीटर रस को मेथनॉल में 1 मिलीलीटर डीपीपीएच विलयन (100 μM) के साथ मिलाया गया। 30 मिनट तक अंधेरे में अभिक्रिया होने के बाद, शिमाद्ज़ू यूवी स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (UV-1601 PC) का उपयोग करके 517 nm पर मिश्रण के अवशोषण को मापा गया। परिणामों को अंशांकन वक्र के आधार पर ट्रोलोक्स समतुल्य (μM ट्रोलोक्स/ml) के रूप में व्यक्त किया गया।R2= 0.990).
प्राप्त आंकड़ों से पता चला कि किण्वन के 18वें दिन के अंत तक एनआरसी 620 ऑयस्टर मशरूम में लैकेस एंजाइम का अधिकतम उत्पादन देखा गया, जो 1302 यू/लीटर की गतिविधि तक पहुँच गया। इसी के आधार पर लैकेस उत्पादन के लिए इष्टतम संवर्धन समय निर्धारित किया गया (चित्र 1)। यद्यपि संवर्धन समय बढ़ने के साथ एंजाइम उत्पादन में वृद्धि हुई, लेकिन वृद्धि की दर संवर्धन समय के सीधे समानुपाती नहीं थी; 21 दिनों के बाद, एंजाइम गतिविधि में केवल 90 यू/लीटर की वृद्धि हुई (1390 यू/लीटर तक)। इसलिए, उत्पाद की उपज और संवर्धन समय में वृद्धि के आर्थिक लाभों के बीच संतुलन बनाए रखने के लिए अंततः 18 दिनों को इष्टतम संवर्धन समय के रूप में चुना गया।
प्लेरोटस ऑस्ट्रिएटस एनआरसी 620 में लैकेस उत्पादन पर संवर्धन समय का प्रभाव। तीन (12 मिमी) कवक माइसेलियल ब्लॉकों को 50 मिलीलीटर बाँझ माध्यम में डाला गया और फिर 28 डिग्री सेल्सियस पर अलग-अलग समय के लिए संवर्धित किया गया।
अन्य अध्ययनों के अनुरूप, हमारे परिणाम बताते हैं कि कवक द्वारा लैकेस के अधिकतम स्राव को प्राप्त करने के लिए आदर्श संवर्धन अवधि 7 से 36 दिनों के बीच होने की संभावना है।32एज़िक एट अल के अनुसार।33*ट्रैमेट्स पॉलीज़ोना* WRF03 ने किण्वन के नौवें दिन के अंत तक लैकेस की उच्चतम मात्रा का उत्पादन किया, जिसकी विशिष्ट गतिविधि 1637 U/mg प्रोटीन थी। इसके अलावा, ओथमान एट अल.34हमने पाया कि *ट्राइकोडर्मा हारज़ियानम* S7113 ने संवर्धन के पाँचवें दिन बड़ी मात्रा में लैकेस स्रावित किया। लैकेस उत्पादन दर चौदहवें दिन चरम पर पहुँच गई और फिर धीरे-धीरे कम हो गई।34हालांकि एंजाइम का स्राव मुख्य वृद्धि चरण के दौरान भी हो सकता है, लेकिन यह आमतौर पर मध्यवर्ती चरण के दौरान चरम पर होता है और कार्बन या नाइट्रोजन स्रोत की खपत से प्रेरित होता है।34,35
हालांकि प्लुरोटस ऑस्ट्रिएटस एनआरसी 620 से प्राप्त लैकेस एंजाइम ने 50°C से 80°C तक के व्यापक तापमान रेंज में उच्च सक्रियता प्रदर्शित की, जो लगभग चरम सक्रियता (69-98%) तक पहुंच गई, लेकिन इसकी अधिकतम सक्रियता 70°C पर देखी गई (चित्र 2a)। इस तापमान रेंज के बाहर, एंजाइम की सक्रियता लगभग 70°C पर कम हो गई। ये परिणाम बताते हैं कि एंजाइम उच्च तापमान पर सक्रिय होता है, संभवतः इसलिए क्योंकि उच्च तापमान अभिक्रिया की गतिज ऊर्जा को बढ़ा देता है।
*Pleurotus ostreatus* NRC 620 में लैकेस एंजाइम की सक्रियता पर अभिक्रिया तापमान (a) और pH (b) का प्रभाव। एंजाइम मिलाने और अभिक्रिया शुरू करने से पहले मिश्रण को अलग-अलग तापमानों पर 5 मिनट तक प्री-इनक्यूबेट करके 20 से 90 डिग्री सेल्सियस तक के तापमान प्राप्त किए गए। pH के प्रभाव का आकलन 2.5 से 7.0 की pH सीमा में 0.1 M साइट्रेट-फॉस्फेट बफर युक्त विलयनों में ABTS को सबस्ट्रेट के रूप में उपयोग करके किया गया।
एज़िक एट के अनुसारअल.33ट्रैमेट्स पॉलीज़ोना डब्ल्यूआरएफ03 लैकेस के लिए इष्टतम तापमान 55 डिग्री सेल्सियस है, जो गैनोडर्मा ल्यूसिडम के लिए भी समान है।लैकेस36और यह ट्रैमेट्स पॉलीज़ोना (Ku-RNW02737) के लिए इष्टतम तापमान (50 डिग्री सेल्सियस) के समान है।लैकेस . बाल्ड्रियन38ध्यान दें कि, अन्य लिग्निन-अपघटनकारी एंजाइम प्रणालियों की तरह, लैकेस के लिए आदर्श तापमान सीमा 50 और 70 डिग्री सेल्सियस के बीच है।
परिणामों से पता चला कि एंजाइम ने pH 3.0 पर उच्चतम गतिविधि प्रदर्शित की, जो pH 3.5 पर 94% गतिविधि तक पहुँच गई। हालाँकि, यह 2.5 से 7.0 तक की विस्तृत pH सीमा में सक्रिय रहा (चित्र 2b)। इसके अलावा, इसने तटस्थ या क्षारीय स्थितियों की तुलना में अम्लीय स्थितियों में उच्च गतिविधि प्रदर्शित की। इसकी गतिविधि 2.5 से 4.5 तक की pH सीमा में कम से कम 77% बनी रही, लेकिन pH 7.0 पर केवल लगभग 38% तक पहुँची। *Trametes polyzona* WRF03 से लैकेस के लिए इष्टतम pH 4.533 था, जो *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzanium* 39, *Pleurotus* sp. 40, और *Trametes hirsuta* 41 से लैकेस के pH के समान है। हालाँकि, चेयरिन एट अल. के अध्ययन के अनुसार42*पॉलीमॉर्फा एफ. एसपी.* WR710-1 से लैकेस के लिए इष्टतम pH 2.2 है, जबकि *पॉलीमॉर्फा एफ. एसपी.* IBL-04 से लैकेस के लिए इष्टतम pH 5.043 है। T2/T3 लैकेस के तांबे के परमाणुओं से हाइड्रॉक्साइड आयनों (लैकेस अवरोधक) का बंधन तटस्थ या क्षारीय pH स्थितियों के तहत लैकेस गतिविधि में कमी का कारण हो सकता है। यह T1 केंद्र से T2/T3 केंद्र तक आंतरिक इलेक्ट्रॉन स्थानांतरण को बाधित कर सकता है, जिससेसीमितएंजाइम गतिविधि23,44
एंजाइम को विभिन्न तापमानों पर इनक्यूबेट करने पर यह पाया गया कि इनक्यूबेशन का समय और तापमान दोनों ही एंजाइम की स्थिरता को प्रभावित करते हैं। विशेष रूप से, *ट्रैमेट्स पॉलीज़ोना* NRC 620 से प्राप्त लैकेस एंजाइम ने 40℃ और 50℃ पर उच्च स्थिरता प्रदर्शित की, और 120 मिनट के बाद अपनी प्रारंभिक गतिविधि का क्रमशः 68.33% और 59.61% बनाए रखा (चित्र 3a)। इसके विपरीत, समान परिस्थितियों (40℃ और 50℃, 120 मिनट) में, *ट्रैमेट्स पॉलीज़ोना* WRF03 से प्राप्त लैकेस एंजाइम ने अपनी गतिविधि का क्रमशः 64.38% और 42.92% बनाए रखा।33इसके विपरीत, ऊष्मायन समय और तापमान बढ़ाने से *ट्रैमेट्स पॉलीज़ोना* एनआरसी 620 लैकेस की स्थिरता कम हो गई; 60℃ और 70℃ पर 60 मिनट तक ऊष्मायन के बाद, इसकी गतिविधि क्रमशः 39.24% और 1.72% तक कम हो गई (चित्र 3a)। प्रायोगिक परिणामों के अनुरूप, *ट्रैमेट्स पॉलीज़ोना* WRF03 से प्राप्त लैकेस ने तापीय उपचार प्रक्रिया के दौरान 40 और 50℃ पर उच्च स्थिरता प्रदर्शित की।33इसी प्रकार, Lueangjaroenkit etअल.37और चेयरिन एटअल.42ट्रैमेट्स पॉलीज़ोना KURNW027 और ट्रैमेट्स पॉलीज़ोना WR710-1 से प्राप्त लैकेस एंजाइमों की स्थिरता को क्रमशः 50 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे तक परखने की सूचना दी गई है। विभिन्न जैव प्रौद्योगिकी क्षेत्रों में उपयोगी जैव उत्प्रेरक के रूप में, लैकेस एंजाइम में तापमान की व्यापक सीमा पर अच्छी स्थिरता और कार्यक्षमता होनी चाहिए।
*Pleurotus ostreatus* NRC 620 से प्राप्त लैकेस एंजाइम की थर्मोस्टैटिक स्थिरता (a) और pH स्थिरता (b)। थर्मोस्टैटिक स्थिरता का आकलन एंजाइम विलयन को 0.05 M सोडियम फॉस्फेट बफर (pH 7.0) में क्रमशः 40, 50, 60 और 70 °C पर 2 घंटे तक इनक्यूबेट करके किया गया। pH स्थिरता का आकलन एंजाइम विलयन को 0.1 M साइट्रेट बफर और ट्रिस बफर (pH 3, 4, 6 और 7) में 40 °C पर 2 घंटे तक इनक्यूबेट करके किया गया। इनक्यूबेशन के बाद ABTS को सबस्ट्रेट के रूप में उपयोग करके अवशिष्ट गतिविधि की गणना की गई।
एंजाइम के उपयोग और भंडारण के लिए इष्टतम स्थितियों का निर्धारण करने के लिए, हमने लैकेस की स्थिरता पर pH के प्रभाव का अध्ययन किया। विभिन्न pH मानों के संपर्क में आने से प्रोटीन संरचना की स्थिरता पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ा, जिससे एंजाइम अणु की स्थिरता और गतिविधि प्रभावित हुई। परिणामों से पता चला कि एंजाइम अम्लीय परिस्थितियों में कम स्थिर था, जबकि उच्च pH मानों (उदासीन और क्षारीय क्षेत्रों) पर इसकी स्थिरता बेहतर थी। pH मान 7.0, 6.0, 4.0 और 3.0 पर, 120 मिनट के बाद एंजाइम प्रतिधारण दर क्रमशः लगभग 100%, 62.54%, 52.39% और 11.14% थी (चित्र 3b)। *स्ट्रोम्बस मल्टीसस* WRF03 लैकेस ने उदासीन pH मानों (5.5-6.5) पर उच्च स्थिरता और अम्लीय pH मानों (4.0 से नीचे) पर कम स्थिरता दिखाई। पीएच मान 5.5, 6.0 और 6.5 पर 120 मिनट के बाद, एंजाइम प्रतिधारण दरें क्रमशः लगभग 82%, 100% और 93% थीं।33खैरिन एट अल.42यह नोट किया गया कि ट्रैमेट्स पॉलीज़ोना WR710-1 से लैकेस 6.0 से 7.0 के pH रेंज में स्थिर था, जबकि सैय्यद एट अल.45इससे पता चला कि लैकेस उदासीन पीएच स्थितियों में अधिक स्थिर होता है। हालांकि, सेरेना यूनिकलर से प्राप्त लैकेस क्षारीय स्थितियों (पीएच 9.0) में भी स्थिरता प्रदर्शित करता है।46अध्ययन किए गए लैकेस एंजाइमों ने पीएच की एक विस्तृत श्रृंखला में उच्च स्थिरता प्रदर्शित की। यह औद्योगिक अनुप्रयोगों के लिए एक महत्वपूर्ण विशेषता हो सकती है।
कुछ धातु आयनों का एंजाइम गतिविधि पर उत्तेजक और अवरोधक दोनों प्रभाव होता है, इसलिए औद्योगिक अनुप्रयोगों में एंजाइम गतिविधि पर उनके प्रभावों को ध्यान में रखना आवश्यक है। यह महत्वपूर्ण है क्योंकि धातु आयन सामान्य पर्यावरणीय प्रदूषक हैं जो बाह्यकोशिकीय एंजाइमों की स्थिरता और संश्लेषण को प्रभावित कर सकते हैं।47*Pleurotus ostreatus* NRC 620 से प्राप्त लैकेस एंजाइम पर कई धातु आयनों के प्रभावों की जांच करने के लिए, हमने संबंधित प्रयोग किए। जैसा कि चित्र 4 में दिखाया गया है, उपयोग की गई धातु के प्रकार के आधार पर, धातु आयन की सांद्रता को 2.5 mM से 10 mM तक बढ़ाने से एंजाइम के कार्य पर नकारात्मक प्रभाव पड़ा। उदाहरण के लिए,Mg²⁺ , Co²⁺ , Zn²⁺, औरCu²⁺यह एंजाइम गतिविधि को उत्तेजित और सक्रिय कर सकता है, जबकिNa⁺ , Mn²⁺ , Ca²⁺, औरK⁺ये एंजाइम गतिविधि को बाधित कर सकते हैं। 10 mM की सांद्रता पर, Cu²⁺ और Mg²⁺ आयन *Pleurotus ostreatus* NRC 620 से लैकेस गतिविधि के सबसे शक्तिशाली सक्रियक थे, जो क्रमशः लगभग 34% और 20% की सक्रियता प्रदान करते थे। हालांकि, 10 mM की सांद्रता पर, Ca²⁺ आयन लैकेस के सबसे शक्तिशाली अवरोधक थे, जो एंजाइम गतिविधि को लगभग 60% तक कम कर देते थे।
प्ल्यूरोटस ऑस्ट्रिएटस एनआरसी 620 लैकेस एंजाइम की गतिविधि पर धातु आयनों का प्रभाव। लैकेस एंजाइम को 2.5 mM और 10 mM सांद्रता वाले विभिन्न धातु आयनों से युक्त सोडियम फॉस्फेट बफर (0.05 M, pH 7.0) में 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया। इसके बाद सब्सट्रेट (ABTS) मिलाकर अभिक्रिया शुरू की गई, जिसके बाद सापेक्षिक गतिविधि का मापन किया गया।
हमारे परिणाम अन्य लेखकों के निष्कर्षों के अनुरूप हैं जिन्होंने पाया कि Mg²⁺ और Cu²⁺ *Trametes polyzona* WRF03³ की गतिविधि को बढ़ाते हैं। Castaño et al.⁴⁸ ने पाया कि *Xylaria* प्रजाति से प्राप्त लैकेस एंजाइम तांबे के आयनों (Cu²⁺) द्वारा कुछ हद तक उत्तेजित होता है। इसके अलावा, Foroutanfar et al.⁴⁹ और Si et al.⁵⁰ ने क्रमशः *Paraconiothyrium variabile* और *Trametes pubescens* से प्राप्त लैकेस एंजाइमों पर समान अध्ययन किए। इस एंजाइम का टाइप II तांबा-बंधन स्थल (T2) एक निश्चित सांद्रता पर Cu²⁺ से संतृप्त हो सकता है, जो उच्च Cu²⁺³⁹ सांद्रता पर लैकेस गतिविधि के उत्तेजना की व्याख्या कर सकता है। क्योंकि श्वेत सड़न कवक लैकेस कई तांबे के परमाणुओं वाले ऑक्सीडेस होते हैं, इसलिए लैकेस गतिविधि पर तांबे के आयनों का प्रभाव विविध होता है और उत्तेजक और अवरोधक से लेकर तटस्थ तक होता है।⁵¹ इसके विपरीत, झोउ एट अल[52]रिपोर्ट किया किCu²⁺ताइवान के भूमिगत दीमक (Odontotermes formosanus) की लैकेस गतिविधि को बाधित किया। हालाँकि, Cerena sp. HYB07 के लैकेस[53]और क्लिटोसाइब मैक्सिमा[54]तांबे के आयनों से अप्रभावित रहे।
सब्सट्रेट की विशिष्टता को उसके गतिज मापदंडों (Km और Vmax) द्वारा दर्शाया गया था; एंजाइम के प्रति सब्सट्रेट की बंधन क्षमता जितनी अधिक होगी, Km का मान उतना ही कम होगा और सब्सट्रेट की विशिष्टता उतनी ही अधिक होगी।3,21,55*Pleurotus ostreatus* NRC 620 से प्राप्त लैकेस के गतिज मापदंडों (Km और Vmax) को ग्राफपैड प्रिज्म 6.0 सॉफ्टवेयर का उपयोग करके लिनवेवर-बर्क प्लॉट (चित्र 5) बनाकर निर्धारित किया गया। ABTS को सबस्ट्रेट के रूप में उपयोग करने पर परिणाम क्रमशः 1.99 mM और 16217 μmol प्राप्त हुए।मिनट⁻¹ एल⁻¹,क्रमशः। एलसईद एट अल.21रिपोर्ट में बताया गया है कि ABTS ऑक्सीकरण के लिए Km मान क्रमशः 0.1 mM और 0.064 mM थे, जो लैक्टोज ए और लैक्टोज बी आइसोएंजाइमों की ABTS के प्रति उच्च आत्मीयता को दर्शाते हैं। इसके अलावा, Vmax मान 0.182 μmol थे।मिनट⁻¹और 0.603 μmolमिनट⁻¹क्रमशः। प्राप्त Km मान ट्रैमेट्स पॉलीज़ोना WRF03 (8.66 mM) की तुलना में कम था; इसके अलावा, उनका Vmax मान (1429 mmol min⁻¹) भी कम था।निचलाजब ABTS को सब्सट्रेट के रूप में उपयोग किया जाता है।33 इसी तरह, लेंटिनस स्क्वारोसुलस MR13 और ट्रामेट्स एसपी. AH28-2 लैकेस सांद्रता के Km मान क्रमशः 0.0714 mM और 0.025 mM थे, और Vmax मान 0.0091 mM min−1 और 0.67 mM min−1 mg−1 (ABTS के सापेक्ष) थे।क्रमशः.56,57
*Pleurotus ostreatus* NRC 620 से प्राप्त लैकेस एंजाइम की गतिविधि पर ABTS सांद्रता के प्रभाव का अध्ययन किया गया और प्रारंभिक अभिक्रिया वेग के व्युत्क्रम और ABTS सांद्रता के बीच एक लाइनेवेवर-बर्क प्लॉट बनाया गया। लैकेस एंजाइम की विभिन्न सांद्रताओं (0.025–3.0 mM) के साथ ABTS की ऑक्सीकरण अभिक्रिया को pH 4.5 पर मापा गया ताकि गतिज मापदंडों (Vmax और Km) का निर्धारण किया जा सके। अभिक्रिया वेग के व्युत्क्रम और सब्सट्रेट सांद्रता के बीच लाइनेवेवर-बर्क प्लॉट का उपयोग करके माइकलिस-मेंटेन गतिज स्थिरांकों की गणना की गई। ग्राफपैड प्रिज्म 6.01 सॉफ्टवेयर का उपयोग करके लाइनेवेवर-बर्क प्लॉट से गतिज स्थिरांकों की गणना की गई।
परंपरागत स्पष्टीकरण एंजाइम, जैसे कि पेक्टिनेज़, पेक्टिक पदार्थों को हाइड्रोलाइज़ करते हैं, जिससे चिपचिपाहट और धुंधलापन कम होता है। ये संरचनात्मक पॉलीसेकेराइड को प्रभावी ढंग से तोड़ते हैं और अक्सर सेल्युलेज़ और हेमिकेल्युलेज़ जैसे अन्य एंजाइमों के साथ मिलकर उपज और स्पष्टता में सुधार के लिए उपयोग किए जाते हैं। हालांकि, पेक्टिनेज़ विशेष रूप से फेनोलिक यौगिकों को लक्षित नहीं करते हैं, जो धुंधलापन और ऑक्सीडेटिव ब्राउनिंग के मुख्य कारक हैं, विशेष रूप से सेब और अंगूर के रस जैसे जूस में।58इसके विपरीत, लैकेस एंजाइम फेनोलिक यौगिकों के ऑक्सीकरण को उत्प्रेरित करते हैं, जिससे वे बड़े, अघुलनशील अणुओं में परिवर्तित हो जाते हैं जिन्हें अवसादन या निस्पंदन द्वारा अलग किया जा सकता है। यह प्रक्रिया न केवल जूस की स्पष्टता में सुधार करती है बल्कि फेनोलिक यौगिकों के कारण होने वाले ऑक्सीडेटिव ब्राउनिंग की संभावना को कम करके जूस की शेल्फ लाइफ को भी बढ़ाती है। इसके अलावा, लैकेस-आधारित स्पष्टीकरण प्रक्रियाएं हल्के प्रसंस्करण स्थितियों (pH 3.5–5.5, तापमान 25–40 °C) में की जा सकती हैं, जिससे वे नाजुक जूस के लिए उपयुक्त हो जाती हैं और उनके पोषण संबंधी या स्वाद संबंधी गुणों को प्रभावित नहीं करती हैं।59अध्ययनों से पता चला है कि पेक्टिनेज उपचार से रस 1-2 घंटे में साफ हो जाता है, जबकि लैकेस उपचार से फेनोलिक यौगिकों को पूरी तरह से कम करने में आमतौर पर अधिक समय (3-6 घंटे) लगता है। हालांकि, एंजाइम को स्थिर करके या लैकेस को यांत्रिक स्पष्टीकरण विधियों के साथ मिलाकर इस प्रक्रिया को बेहतर बनाया जा सकता है।60इस अध्ययन में, कच्चे अर्क के एंजाइम प्रोफाइलिंग से लैकेस और α-एमाइलेज की महत्वपूर्ण सक्रियता का पता चला, जबकि पेक्टिनेज और जाइलेनेज की सक्रियता अत्यंत कम थी और सेल्युलेज की सक्रियता का पता नहीं चला। इसलिए, मैलापन और फेनोलिक सामग्री में कमी मुख्य रूप से लैकेस की क्रिया के कारण थी, जबकि श्यानता में परिवर्तन आंशिक रूप से एमाइलेज की क्रिया के कारण हो सकता है।
तालिका 1 ताजे निचोड़े हुए सेब के रस और लैकेस-उपचारित नमूनों के भौतिक-रासायनिक मापदंडों को दर्शाती है। परिणामों से पता चला कि ताजे निचोड़े हुए सेब के रस की उपज (71.59%) लैकेस-उपचारित नमूनों (87.34%) की तुलना में कम थी। ये परिणाम पिल्निक और ऑरेंज के निष्कर्षों के अनुरूप हैं।61उन्होंने बताया कि फलों के प्रसंस्करण में एंजाइमों के उपयोग से रस की पैदावार बढ़ सकती है, छानने की प्रक्रिया बेहतर हो सकती है और गाढ़ा करने के लिए उच्च गुणवत्ता वाला, साफ रस प्राप्त किया जा सकता है। रस की पैदावार में वृद्धि मुख्य रूप से रस में घुलनशील शर्करा की मात्रा में वृद्धि के कारण होती है। फलों के एंजाइमेटिक जल अपघटन के दौरान, उत्पाद की कोशिका भित्ति में मौजूद मेसोग्लिया और पेक्टिन नष्ट हो जाते हैं और उदासीन शर्करा और अम्ल जैसे घुलनशील पदार्थों में परिवर्तित हो जाते हैं।62.एंजाइम से उपचारित सेब के रस का पीएच मान नियंत्रण समूह की तुलना में काफी कम था (P < 0.05), और भंडारण के दौरान दोनों समूहों के पीएच मान में उल्लेखनीय वृद्धि हुई (तालिका 1)। ये परिणाम मार्क एट अल. के परिणामों के अनुरूप हैं।63उन्होंने पाया कि ऊष्मा उपचार के बाद भंडारण में काजू के रस का पीएच मान कम हो गया। एंजाइम उपचार के बाद पेक्टिन का अपघटन और गैलेक्ट्यूरोनिक अम्ल का निर्माण भंडारण के दौरान पीएच मान में वृद्धि का कारण हो सकता है। एंजाइम उपचारित नमूनों का पीएच मान भंडारण के दौरान 4.05 और 4.31 के बीच बना रहा, जबकि अनुपचारित सेब के रस का पीएच मान 4.12 और 4.33 के बीच रहा।
बिना उपचारित और लैकेस-उपचारित दोनों नमूनों की कुल अम्लता (टीए) भंडारण समय बढ़ने के साथ घटती हुई प्रतीत हुई (तालिका 1)। अम्लता में यह कमी रस के भंडारण के दौरान कार्बनिक अम्लों के कार्बोहाइड्रेट में रूपांतरण या एंजाइमेटिक प्रतिक्रियाओं के साथ-साथ ऑक्सीकरण के कारण हुई।64नियंत्रित सेब के रस और एंजाइम-उपचारित नमूनों की कुल अम्लता अन्य रसों (स्ट्रॉबेरी का रस 0.9%, बेर का रस 2.2%, कुमकुम का रस 1.0%, खुबानी का रस 2.4%, संतरे का रस 0.8%) की तुलना में कम थी, लेकिन अन्य रसों (जैसे, नाशपाती का रस 0.3%) के समान थी।62बिना उपचारित ताजे निचोड़े हुए सेब के रस में ये अंतर विभिन्न कारकों जैसे कि उगाने की स्थितियाँ, आनुवंशिक कारक, परिपक्वता स्तर और प्रसंस्करण विधियों के कारण हो सकते हैं।65नियंत्रण और लैकेस-उपचारित सेब के रस की कुल अम्लता में कमी सिंह एट अल द्वारा प्रस्तुत परिणामों के अनुरूप है।6674 दिनों के भंडारण के बाद जिन नुओ सेब के रस की कुल अम्लता में कमी के संबंध में। दूसरी ओर, ओश्मियान्स्की और वोज्डिलो67पारंपरिक स्पष्टीकरण विधियों के प्रभाव का अध्ययन करते समय सेब के रस की अम्लता में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं पाया गया।
तालिका 1 में प्रस्तुत परिणाम दर्शाते हैं कि लैकेस से उपचारित सेब के रस का कुल घुलनशील ठोस (टीएसएस) मान अनुपचारित नमूने की तुलना में अधिक था। ये परिणाम प्रकाशित अध्ययनों के अनुरूप हैं।. 68इसके अलावा, तालिका 1 से पता चलता है कि नियंत्रण सेब के रस समूह का टीएसएस मान प्रारंभिक समय में 9.58 था और भंडारण अवधि के अंत तक 11.05 तक पहुँच गया। ये मान हामिद एट अल द्वारा रिपोर्ट किए गए ताजे सेब के रस के टीएसएस मानों से कम हैं।. 69(क्रमशः 11.2 और 11.80)। लैकेस से उपचारित सेब के रस के नमूनों का टीएसएस मान 11.23 से बढ़कर 4°C पर दो सप्ताह के भंडारण के बाद 12.93 तक पहुँच गया (तालिका 1)। भंडारण के दौरान टीएसएस में इसी तरह की वृद्धि खट्टे फलों, नींबू और मीठे संतरे में भी देखी गई। भंडारण के दौरान कुल घुलनशील ठोस (टीएसएस) में वृद्धि पॉलीसेकेराइड (स्टार्च) के मोनोसेकेराइड (शर्करा) में जल अपघटन, रस के निर्जलीकरण के कारण सांद्रता में वृद्धि और रस में पेक्टिन के घुलनशील ठोस में विघटन के कारण हो सकती है। कुल घुलनशील ठोस (टीएसएस) में वृद्धि संभवतः घुलनशील शर्करा में वृद्धि के कारण है, जो पेक्टिन या सेल्युलेज द्वारा क्रमशः पेक्टिन या सेल्युलोज के घुलनशील शर्करा में रूपांतरण से या स्टार्च के शर्करा में जल अपघटन से बन सकती है, जैसा कि हमेद एट अल द्वारा रिपोर्ट किया गया है।69.सेब के रस के गुणों पर लैकेस एंजाइम के प्रभाव को प्रत्यक्ष रूप से देखा जा सकता है, क्योंकि लैकेस से उपचारित सेब का रस बिना उपचारित रस की तुलना में बेहतर प्रवाहशीलता और कम चिपचिपाहट प्रदर्शित करता है। यह अवलोकन तालिका 1 में दर्ज किया गया है; एंजाइम से उपचारित नमूने की चिपचिपाहट 1.87 cP थी, जबकि नियंत्रण नमूने की चिपचिपाहट 2.95 cP थी। चिपचिपाहट में यह महत्वपूर्ण कमी संभवतः पेक्टिन जैसे पदार्थों की उच्च जल धारण क्षमता और एक सुसंगत नेटवर्क संरचना के निर्माण के कारण है।
इस अध्ययन में, स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 420 एनएम पर अवशोषण को मापकर सेब के रस के भूरेपन सूचकांक (बीआई) पर लैकेस के प्रभाव की जांच की गई। परिणाम तालिका 1 में दर्शाए गए हैं। भंडारण के दौरान, उपचारित और अनुपचारित दोनों समूहों में सेब के रस के नमूनों के बीआई में धीरे-धीरे वृद्धि देखी गई। बीआई भूरेपन की मात्रा को दर्शाता है और इसका उपयोग ब्राउनिंग इंडेक्स (बीआई) के संकेतक के रूप में किया जा सकता है।एक महत्वपूर्णएंजाइमेटिक और गैर-एंजाइमेटिक ब्राउनिंग प्रतिक्रियाओं का सूचक। भंडारण के दौरान अवशोषण में उल्लेखनीय वृद्धि हुई (P < 0.05)। भंडारण के अंत में,ए420नियंत्रण और एंजाइम-उपचारित समूहों में सेब के रस के नमूनों का मूल्य क्रमशः लगभग 217% और 121% बढ़ गया (तालिका 1)। परिणाम बताते हैं कि एंजाइम उपचार भूरेपन की मात्रा को लगभग 56% तक प्रभावी ढंग से कम कर सकता है। बेजेरा एट अल. के परिणाम।[19हमारे परिणाम भी इससे मेल खाते हैं; उन्होंने सेब के रस को साफ करने के लिए लैकेस-ग्लूटाराल्डिहाइड-नारियल फाइबर का इस्तेमाल किया, जिससे उसका मूल रंग 61% तक कम हो गया।
हालांकि फलों के रस में मौजूद पॉलीफेनॉल मानव शरीर पर सकारात्मक पोषण और चिकित्सीय प्रभाव डालते हैं, लेकिन वे प्रोटीन के साथ प्रतिक्रिया भी कर सकते हैं, जिससे रस में धुंधलापन, तलछट या मैलापन आ सकता है, जिससे उत्पाद का स्वाद और सुगंध बदल जाता है और उसकी शेल्फ लाइफ कम हो जाती है।71इस अध्ययन का उद्देश्य प्लुरोटस ऑस्ट्रिएटस एनआरसी 620 से प्राप्त लैकेस एंजाइम का उपयोग करके सेब के रस में फेनोलिक यौगिकों की मात्रा को सुरक्षित रूप से कम करना था। तालिका 1 में प्रस्तुत परिणाम दर्शाते हैं कि लैकेस से उपचारित सेब के रस में फेनोलिक यौगिकों की कुल मात्रा 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण से पहले काफी कम हो गई थी। इसके अलावा, अध्ययन किए गए दोनों नमूनों में भंडारण के दौरान भी फेनोलिक यौगिकों की कुल मात्रा में कमी आई (तालिका 1)। सैंड्री एट अल. द्वारा किया गया शोध।72अध्ययन से पता चला है कि एंजाइम से उपचारित सेब का रस अपनी एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि और फेनोलिक यौगिक सामग्री को बरकरार रख सकता है। हालाँकि, लेटररा एट अल द्वारा किए गए एक अध्ययन के परिणाम...73यह दर्शाता है कि संतरे के रस को फंगल लैकेस से उपचारित करने पर उसमें मौजूद फेनोलिक यौगिकों की मात्रा 45% तक कम हो सकती है।
फेनोलिक यौगिकों में मुक्त कणों को नष्ट करने, एकल ऑक्सीजन को कम करने और बुझाने, हाइड्रोजन परमाणु स्थानांतरण और मुक्त कणों को इलेक्ट्रॉन दान करने जैसे गुण पाए जाते हैं, जो उन्हें शक्तिशाली एंटीऑक्सिडेंट बनाते हैं।74इसलिए, इस अध्ययन में, 14 दिनों तक रेफ्रिजरेटर में रखे गए सेब के रस की एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि पर लैकेस के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए DPPH और FRAP आधारित विधियों का उपयोग किया गया (तालिका 2)। दोनों विधियों ने भंडारण के दौरान एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि में वृद्धि दिखाई, जो मुक्त फेनोलिक यौगिकों में वृद्धि या मैलार्ड प्रतिक्रिया उत्पादों (MRPs) के निर्माण के कारण हो सकती है, और संभवतः मैलार्ड प्रतिक्रिया उत्पाद ही एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि में वृद्धि का कारण हैं।75गैर-एंजाइमेटिक ब्राउनिंग प्रतिक्रियाओं (जिसमें एस्कॉर्बिक एसिड का अपघटन, मैलार्ड प्रतिक्रियाएं और शर्करा का अम्ल-उत्प्रेरित अपघटन शामिल हैं) से भूरे रंग के पिगमेंट (मेलानोइडिन) उत्पन्न होते हैं। एस्कॉर्बिक एसिड के अपघटन से बनने वाले मध्यवर्ती उत्पाद और शर्करा के अपघटन से बनने वाले उत्पाद (जैसे कार्बोनिल यौगिक) मैलार्ड प्रतिक्रियाओं के माध्यम से अमीनो एसिड के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं।76हालांकि भंडारण के दौरान फलों और सब्जियों के भूरे पड़ने का व्यापक रूप से अध्ययन किया गया है, लेकिन इन प्रतिक्रियाओं के बारे में हमारी समझ अभी भी सीमित है।77FRAP विधि की तुलना में, लैकेस-उपचारित सेब के रस ने DPPH विधि द्वारा काफी कम एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि दिखाई (तालिका 2), और भंडारण समय बढ़ने के साथ सभी नमूनों की एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि में उल्लेखनीय वृद्धि हुई। इस अध्ययन में एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि निर्धारित करने के लिए दो अलग-अलग विधियों का उपयोग किया गया क्योंकि उनके सिद्धांत भिन्न हैं। DPPH विधि मुक्त कणों को बेअसर करने की क्षमता को मापती है, जबकि FRAP विधि लौह आयनों को कम करने की क्षमता को मापती है। इसलिए, अध्ययन किए गए नमूनों की एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि को बेहतर ढंग से समझने के लिए एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि निर्धारित करने के लिए कई विधियों का उपयोग करने की सलाह दी जाती है।78
इस अध्ययन के प्रमुख निष्कर्षों में से एक यह है कि *प्ल्यूरोटस ऑस्ट्रिएटस* लैकेस एनआरसी 620 70°C तापमान और 3.0 pH पर इष्टतम सक्रियता प्रदर्शित करता है। रस शुद्धिकरण के लिए आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले अन्य कवक लैकेस, जैसे कि *ट्रैमेट्स वर्सिकोलर* और *गैनोडर्मा ल्यूसिडम* लैकेस की तुलना में, *प्ल्यूरोटस ऑस्ट्रिएटस* एनआरसी 620 उच्च तापीय स्थिरता और अधिक अम्लीय pH प्रदर्शित करता है। *ट्रैमेट्स वर्सिकोलर* और *गैनोडर्मा ल्यूसिडम* से प्राप्त लैकेस आमतौर पर 50-60°C तापमान और 3.5 से 5.0 के pH मानों के बीच इष्टतम सक्रियता प्रदर्शित करते हैं। यह अंतर रस शुद्धिकरण दक्षता में सुधार में योगदान दे सकता है, विशेष रूप से अम्लीय रसों के लिए जहां कम pH मानों पर स्थिरता महत्वपूर्ण है। *प्ल्यूरोटस ऑस्ट्रिएटस* एनआरसी 620 की अनूठी विशेषता यह है कि यह अधिक चुनौतीपूर्ण परिस्थितियों में भी प्रभावी ढंग से कार्य करने की क्षमता प्रदर्शित करता है। इसका उच्चतर इष्टतम सक्रियण तापमान औद्योगिक अनुप्रयोगों में संभावित लाभों का संकेत देता है, जैसे कि तीव्र प्रतिक्रिया दर और कम सूक्ष्मजीवीय संदूषण। इसका निम्न pH, जो कई रसों की अम्लीय प्रकृति के अनुकूल है, रस शोधन प्रक्रियाओं में उपयोगी हो सकता है। ये परिणाम बड़े पैमाने पर अनुप्रयोग के लिए आगे की खोज को उचित ठहराते हैं, जिससे *Pleurotus ostreatus* NRC 620 पारंपरिक कवक लैकेस स्रोतों का एक व्यवहार्य विकल्प बन जाता है। पिछले अध्ययनों की तुलना में, हमने पाया कि इष्टतम तापमान 60°C और इष्टतम pH 3.0 है। 60°C पर 80 मिनट की प्रतिक्रिया के बाद, *Ganoderma lucidum* लैकेस बरकरार रहा।46इसकी गतिविधि का %.79 कुर्नियावती और निकेल के अनुसार80गैनोडर्मा ल्यूसिडम एंजाइम 25°C तापमान और 5.0 से 8.0 के pH मानों पर उत्कृष्ट से मध्यम स्थिरता प्रदर्शित करते हैं, और pH 6.0 और 10 से 30°C के तापमान पर भी स्थिरता बनाए रखते हैं। इस अध्ययन में, हमने पाया कि प्लुरोटस ऑस्ट्रिएटस एंजाइम की सक्रियता के लिए इष्टतम pH और तापमान क्रमशः 3.0 और 70°C थे। 40°C और 50°C पर दो घंटे तक ऊष्मायन के बाद, एंजाइम ने अपनी सक्रियता का क्रमशः 68.33% और 59.61% बनाए रखा। इसके अलावा, प्लुरोटस ऑस्ट्रिएटस एनआरसी 620 लैकेस ने 50°C से 80°C तक के व्यापक तापमान पर उच्च सक्रियता प्रदर्शित की, लगभग अधिकतम सक्रियता (69%–98%) तक पहुँचते हुए, अधिकतम सक्रियता 70°C पर देखी गई।
निष्कर्षतः, स्थिर परिस्थितियों में प्राप्त ऑयस्टर मशरूम लैकेस NRC620 ने pH और तापमान की विभिन्न स्थितियों में इष्टतम सक्रियता और स्थिरता प्रदर्शित की, जो अन्य एंजाइम स्रोतों की तुलना में बेहतर स्थिरता दर्शाती है। 10 mM MgSO₄ और CuSO₄ मिलाने से एंजाइम की सक्रियता में क्रमशः लगभग 21% और 35% की वृद्धि हुई। सेब के रस में संसाधित करने पर, एंजाइम ने pH और श्यानता को कम किया, जबकि भंडारण के दौरान फेनोलिक सामग्री में मामूली कमी आई।
इन परिणामों से खाद्य उद्योग, विशेष रूप से पेय पदार्थों के शुद्धिकरण में लैकेस एंजाइम की क्षमता की पुष्टि होती है। फेनोलिक यौगिकों को विशेष रूप से विघटित करके, लैकेस न केवल धुंधलापन कम करता है और स्पष्टता बढ़ाता है, बल्कि सामान्य परिचालन स्थितियों में फलों के रस की गुणवत्ता को भी बनाए रखता है। जिलेटिन, बेंटोनाइट और सिलिका जेल जैसे पारंपरिक शुद्धिकरण एजेंटों के विपरीत, लैकेस अपशिष्ट उत्पन्न नहीं करता है और पेय पदार्थों से सुखद सुगंध को नष्ट नहीं करता है, जिससे यह अधिक पर्यावरण के अनुकूल और टिकाऊ विकल्प बन जाता है। इसके अलावा, अन्य एंजाइमों और निस्पंदन विधियों की तुलना में, लैकेस उत्पाद की गुणवत्ता से समझौता किए बिना एक लक्षित और लागत प्रभावी समाधान प्रदान करता है।
क्योमुहिम्बो, एच.डी. और ब्रिंक, एच.जी. तांबा युक्त लैकेस के अनुप्रयोग और स्थिरीकरण रणनीतियाँ; एक समीक्षा। हेलियन 9, ई13156 (2023)।
पोस्ट करने का समय: 15 दिसंबर 2025